Необратимое ингибирование

Необратимые ингибиторы связывают или разрушают функциональную группу молекулы фермента, необходимую для проявления его каталитической активности. Происходит формирование стабильного комплекса ингибитора с ферментом, ведущее к его необратимой инактивации. Случай необратимого ингибирования можно обнаружить по тому признаку, что при разбавлении раствора не происходит повышения удельной активности фермента, как в случае обратимого ингибирования.

Примером необратимого ингибитора может служить соединение диизопропилфторфосфат (ДФФ), которое ингибирует фермент ацетилхолинэстеразу, играющий важную роль в передаче нервных импульсов. Ацетилхолинэстераза катализирует гидролиз ацетилхолина, функционирующего в качестве нейромедиатора в определенных отделах нервной системы. Ацетилхолин выделяется стимулированной нервной клеткой в синапс, т.е. место соединения одного нейрона с другим. В синапсе ацетилхолин связывается с рецепторами следующего нейрона, вынуждая его проводить нервный импульс. Однако прежде чем второй импульс будет передан через синапс следующему нейрону, ацетилхолин, выделившийся после первого импульса, должен быть гидролизован ацетилхолинэстеразой в месте соединения нервных клеток. Продукты его распада - ацетат и холин - не способны действовать как нейромедиаторы. Необратимый ингибитор ДФФ, обладающий высокой реакционной способностью, присоединяется к гидроксильной группе остатка серина в активном центре ацетилхолинэстеразы, что приводит к образованию каталитически неактивного производного. В результате фермент перестает функционировать. ДФФ, одно из первых отравляющих веществ нервнопаралитического действия, в опытах на животных вызывает нарушение некоторых функций вследствие того, что пораженные нейроны утрачивают способность проводить нервные импульсы. Однако ДФФ обладает и полезными свойствами. На его основе был создан ряд относительно нетоксичных для людей и животных инсектицидов, например малатион. Сам по себе малатион неактивен и в организме высших животных разлагается на продукты, которые считаются безвредными. В организме же насекомых малатион превращается под действием ферментов в активный ингибитор их собственной ацетилхолинэстеразы.

Выяснилось, что ДФФ ингибирует целый класс ферментов, многие из которых способны катализировать гидролиз пептидов или эфирных связей. К этим ферментам относится не только ацетилхолинэстераза, но и трипсин, химотрипсин, эластаза, фосфоглюкомутаза и коконаза (фермент, выделяемый личинкой тутового шелкопряда и используемый ею для гидролиза шелковых нитей и освобождения из кокона). Характерная особенность всех ферментов, ингибируемых ДФФ, состоит в том, что они содержат в активном центре остаток серина, принимающий участие в каталитическом акте

Другой необратимый ингибитор некоторых ферментов, иодацетамид может взаимодействовать с сульфгидрильными (--SH) группами остатков цистеина или с имидазольными группами остатков гистидина, содержащихся в активных центрах этих ферментов. С помощью таких ингибиторов было установлено, что гидроксильная группа серина, тиоловая группа цистеина и имидазольная группа гистидина участвуют в каталитической активности ферментов, принадлежащих к разным классам.

Аллостерическое ингибирование

Аллостерические ингибиторы связываются с отдельными участками фермента вне активного центра. Такое связывание влечет за собой конформационные изменения в молекуле фермента, которые приводят к уменьшению его активности. Аллостерические эффекты встречаются практически только в случае олигомерных ферментов. Кинетику таких систем нельзя описать с помощью простой модели Михаэлиса-Ментен.

Так, йодацетат IСН 2 --СООН, его амид и этиловый эфир, пара-хлормеркурибензоат ClHg--С 6 Н 4 --СООН и другие реагенты сравнительно легко вступают в химическую связь с некоторыми SH-группами ферментов. Если такие группы имеют существенное значение для акта катализа, то добавление подобных ингибиторов приводит к полной потере активности фермента:

R-SH + IСН 2 --СООН --> НI + R--S--CH 2 --COOH

Действие ряда других ферментов (холинэстераза, трипсин и химотрипсин) сильно тормозится некоторыми фосфорорганическими соединениями, например ДФФ, вследствие блокирования ключевой гидроксильной группы серина в активном центре (Северин Е.С., 2004).

Ингибирование ферментов . Ингибитор – это вещество, вызывающее специфическое снижение активности фермента. Следует различать ингибирование и инактивацию. Инактивация – это, например, денатурация белка в результате действия денатурирующих агентов.

По прочности связывания ингибитора с ферментом ингибиторы делят на обратимые и необратимые.

Необратимые ингибиторы прочно связаны и разрушают функциональные группы молекулы фермента, которые необходимы для проявления его каталитической активности. Все процедуры по очистке белка не влияют на связь ингибитора и фермента. Пр.: действие фосфорорганических соединений на фермент – холинэстеразу. Хлорофос, зарин, зоман и др. фосфорорганические соединения связываются с активным центром холинэстеразы. В результате происходит фосфорилирование каталитических групп активного центра фермента. В следствии молекулы фермента, связанные с ингибитором, не могут связываться с субстратом и наступает тяжелое отравление.

Также выделяют обратимые игнибиторы , например прозерин для холинэстеразы. Обратимое ингибирование зависит от концентрации субстрата и ингибитора и снимается избытком субстрата.

По механизму действия выделяют:

Конкурентное ингибирование;

Неконкурентное ингибирование;

Субстратное ингибирование;

Аллостерическое.

1) Конкурентное (изостерическое) ингибирование – это торможение ферментативной реакции, вызванное связыванием ингибитора с активным центром фермента. При этом ингибитор имеет сходство с субстратом. В процессе происходит конкуренция за активный центр: образуются фермент-субстратные и ингибитор-ферментные комплексы. E+S®ES® EP® E+P; E+I® E. Пр.: сукцинатдегидрогеназная реакция [рис. COOH-CH 2 -CH 2 -COOH®(над стрелкой СДГ, под ФАД®ФАДН 2) COOH-CH=CH-COOH]. Истинным субстратом этой реакции является сукцинат (янтарная к-та). Ингибиторы: малоновая к-та (COOH-CH 2 -COOH) и оксалоацетат (COOH-CO-CH 2 -COOH). [рис. фермента с 3 дырками+ субстрат+ ингибитор= комплекс ингибитора с ферментом]

Пр.: фермент холинэстераза катализирует превращение ацетилхолина в холин: (CH 3) 3 -N-CH 2 -CH 2 -O-CO-CH 3 ® (над стрелкой ХЭ, под – вода) CH 3 СOOH+(CH 3) 3 -N-CH 2 -CH 2 -OH. Конкурентными ингибиторами являются прозерин, севин.

2) Неконкурентное ингибирование – торможение, связанное с влиянием ингибитора на каталитическое превращение, но не на связывание фермента с субстратом. В этом случае ингибитор может связываться и с активным центром (каталитический участок) и вне его.

Присоединение ингибитора вне активного центра приводит к изменению конформации (третичной структуры) белка, вследствие чего изменяется конформация активного центра. Это затрагивает каталитический участок и мешает взаимодействию субстрата с активным центром. При этом ингибитор не имеет сходства с субстратом и это ингибирование нельзя снять избытком субстрата. Возможно образование тройных комплексов фермент-ингибитор-субстрат. Скорость такой реакции не будет максимальной.

К неконкурентным ингибиторам относят:

Цианиды. Они связываются с атомом железа в цитохромоксидазе и в результате этого фермент теряет свою активность, а т.к. это фермент дыхательной цепи, то нарушается дыхание клеток и они гибнут.

Ионы тяжёлых металлов и их органические соединения (Hg, Pb и др.). Механизм их действия связан с соединением их с различными SH-группами. [рис. фермента с SH-группами, иона ртути, субстрата. Все это соединяется в тройной комплекс]

Ряд фармакологических средств, которые должны поражать ферменты злокачественных клеток. Сюда же относятся ингибиторы, использующиеся в сельском хозяйстве, бытовые отравляющие вещества.

3) Субстратное ингибирование(бесконкурентное) – торможение ферментативной реакции, вызванное избытком субстрата. Происходит в результате образования фермент-субстратного комплекса, неспособного подвергаться каталитическому превращению. Его можно снять и уменьшить концентрацию субстрата. [рис. связывания фермента сразу с 2 субстратами]

Использование необратимых ингибиторов представляет большой интерес для выяснения

Бесконкурентное ингибирование. При бесконкурентном ингибировании ингибитор связывается только с фермент-субстратным комплексом , но не со свободным ферментом. Субстрат, связываясь с ферментом, изменяет его конформацию, что делает возможным связывание с ингибитором. Ингибитор меняет конформацию фермента таким образом, что катализ становится невозможным. Для него характерно то, что V и Км изменяются в одинаковой степени.

Ингибирование субстратом - частный случай бесконкурентного ингибирования, когда две молекулы субстрата связываются с ферментом, что препятствует образованию продукта.

Аллостерическое ингибирование: ингибиторы связываются с отдельными участками фермента вне активного центра. Такое связывание влечет за собой конформационные изменения в молекуле фермента , которые приводят к уменьшению его активности . Аллостерические эффекты встречаются практически только в случае олигомерных ферментов. Кинетику таких систем нельзя описать с помощью простой модели Михаэлиса-Ментен.

Необратимое ингибирование наблюдают в случае образования ковалентных стабильных связей между молекулой ингибитора и фермента . Чаще всего модификации подвергается активный центр фермента, В результате фермент не может выполнять каталитическую функцию .

К необратимым ингибиторам относят ионы тяжёлых металлов, например ртути (Hg 2+), серебра (Ag +) и мышьяка (As 3+), которые в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные группы активного центра. Субстрат при этом не может подвергаться химическому превращению. При наличии реактиваторов ферментативная функция восстанавливается . В больших концентрациях ионы тяжёлых металлов вызывают денатурацию белковой молекулы фермента, т.е. приводят к полной инактивации фермента.

Специфические и неспецифические ингибиторы

Использование необратимых ингибиторов представляет большой интерес для выяснения механизма действия ферментов. С этой целью применяют вещества, блокирующие определённые группы активного центра ферментов. Такие ингибиторы называют специфическими. Ряд соединений легко вступает в реакции с определенными химическими группами. Если эти группы участвуют в катализе, то происходит полная инактивация фермента. Диизопропилфторфосфат (ДФФ) относят к специфическим необратимым ингибиторам "сериновых" ферментов, так как он образует ковалентную связь с гидроксильной группой серина, находящегося в активном центре и играющего ключевую роль в процессе катализа.

Ацетат йода, п-хлормеркурибензоат легко вступают в реакции с SH-группами остатков цистеина белков. Эти ингибиторы не относят к специфичным, так как они реагируют с любыми свободными SH-группами белков и называются неспецифическими ингибиторами. Если SH-группы принимают участие непосредственно в катализе, то с помощью этих ингибиторов представляется возможным выявление роли SH-групп фермента в катализе.

Пример лекарственного препарата, действие которого основано на необратимом ингибировании ферментов, - широко используемый препарат аспирин . Противовоспалительный нестероидный препарат аспирин обеспечивает фармакологическое действие за счёт ингибирования фермента циклооксигеназы, катализирующего реакцию образования простагландинов из арахидоновой кислоты. В результате химической реакции ацетильный остаток аспирина присоединяется к свободной концевой NH 2 -группе одной из субъединиц циклооксигеназы. Это вызывает снижение образования продуктов реакции простагландинов, которые обладают широким спектром биологических функций, в том числе являются медиаторами воспаления.

Основные способы регуляции активности ферментов:

аллостерическая регуляция;

регуляция с помощью белок-белковых взаимодействий;

регуляция путём фосфорилирования/дефосфорилирования молекулы фермента;

регуляция частичным (ограниченным) протеолизом.

Организация химических реакций в метаболические пути

Живая клетка - открытая система, при этом она стремится сохранить неизменным свой внутренний состав - клеточный гомеостаз . Метаболизм - совокупность всех метаболических путей, протекающих в клетках организма. Выделяют противоположно направленные процессы: катаболизм и анаболизм. Катаболизм - распад сложных веществ до простых с высвобождением энергии. Анаболизм - синтез из простых более сложных веществ. Метаболические пути согласованы между собой по месту, времени и интенсивности протекания, что обеспечивается сложными и многообразными механизмами регуляции .

Оптимальная активность ферментов, катализирующих реакции одного метаболического пути , достигается благодаря определённой пространственной организации в клетке.

При определенных условиях ингибитор может быть легко отделен от фермента.

Конкурентное обратимое ингибирование

В этом случае вещество, по своей структуре близкое к обычному субстрату фермента, соединяется с активным центром фермента, но не может прореагировать с ним. Находясь здесь, оно преграждает доступ к активному центру любой молекуле настоящего субстрата. Поскольку в этом случае ингибитор и субстрат конкурируют за место на активном центре фермента, эту форму ингибирования называют конкурентным ингибированием . Оно обратимо, так как при увеличении концентрации субстрата скорость реакции возрастает.

6.4. Почему при этих условиях скорость реакции возрастет?

Рис. 6.15 иллюстрирует один из примеров конкурентного ингибирования.

Явление конкурентного ингибирования используется в химиотерапии . Цель химиотерапии - уничтожить при помощи тех или иных химических препаратов возбудителя болезни, не повреждая при этом ткани организма-хозяина. Во время второй мировой войны для борьбы с инфекционными заболеваниями широко применялись сульфаниламидные препараты , или сульфаниламиды , - производные сульфаниловой кислоты. Сульфаниламиды по своей химической структуре близки к парааминобензойной кислоте (ПАБК) - необходимому фактору роста многих патогенных бактерий. ПАБК требуется бактериям для синтеза фолиевой кислоты, которая служит у них кофактором фермента. Действие сульфаниламидов связано с нарушением синтеза фолиевой кислоты из ПАБК.

Животные клетки не чувствительны к сульфаниламидам, хотя им для некоторых реакций и требуется фолиевая кислота. Объясняется это тем, что они используют преобразованную фолиевую кислоту; метаболический путь, который обеспечивал бы ее синтез, у животных отсутствует.

Неконкурентное обратимое ингибирование

Ингибиторы этого рода не родственны по своей структуре субстрату данного фермента; в образовании комплекса с ингибитором участвует в этом случае не активный центр фермента, а какая-нибудь другая часть его молекулы (рис. 6.16). Образование комплекса влечет за собой изменение глобулярной структуры фермента, и, хотя настоящий субстрат при этом к ферменту все же присоединяется, катализ тем не менее оказывается невозможным. В качестве примера можно привести цианид. Он связывается с ионами металлов, выполняющими у некоторых ферментов роль простетической группы (в частности, с ионами меди цитохромоксидазы), и подавляет активность этих ферментов. С повышением концентрации ингибитора скорость ферментативной реакции все более снижается. К моменту насыщения ингибитором она оказывается практически равной нулю.

В медицине активно разрабатываются и используются соединения, изменяющие активность ферментов с целью регуляции скорости метаболических реакций и уменьшения синтеза определенных веществ в организме.

Подавление активности ферментов обычно называют ингибированием , однако это не всегда корректно. Ингибитором называется вещество, вызывающее специфичное снижение активности фермента. Таким образом, неорганические кислоты и тяжелые металлы ингибиторами не являются, а являются инактиваторами , так как снижают активность многих ферментов, т.е. действуют неспецифично .

В научной деятельности для более точного описания процессов ингибирования пользуются кинетикой Михаэлиса-Ментен и ее терминами - максимальная скорость (Vmax) и константа Михаэлиса (Km).

Ингибирование ферментов

Можно выделить два основных направления ингибирования

• по прочности связывания фермента с ингибитором ингибирование бывает обратимым и необратимым .
• по отношению ингибитора к активному центру фермента ингибирование делят на конкурентное и неконкурентное .

Необратимое ингибирование

При необратимом ингибировании происходит связывание или разрушение функциональных групп фермента, необходимых для проявления его активности.

Например, вещество диизопропилфторфосфат прочно и необратимо связывается с гидроксигруппой серина в активном центре фермента ацетилхолинэстеразы , гидролизующей ацетилхолин в нервных синапсах. Ингибирование этого фермента предотвращает распад ацетилхолина в синаптической щели, в результате чего медиатор продолжает оказывать воздействие на свои рецепторы, что бесконтрольно усиливает холинергическую регуляцию.

Аналогично диизопропилфторфосфат ингибирует химотрипсин и другие протеазы, имеющие в активном центре серин (сериновые протеазы).

Диизопропилфторфосфат относится к нервно-паралитическим ядам, аналогичным образом действуют боевые фосфоорганические вещества (зарин, зоман). Сюда же относится вещество "малатион", включенный в инсектициды (карбофос, дихлофос) и превращающийся в организме насекомых в ингибитор ацетилхолинэстеразы, а в организме животных и человека разрушающийся до безвредных продуктов.

Механизм необратимого ингибирования ацетилхолинэстеразы

Еще один пример связан с ингибированием ацетилсалициловой кислотой (аспирином) ключевого фермента синтеза простагландинов – циклооксигеназы . Эта кислота входит в состав противовоспалительных средств и используется при воспалительных заболеваниях и лихорадочных состояниях. Присоединение ацетильной группы к гидроксильной группе серина в активном центре фермента вызывает инактивацию последнего и прекращение синтеза простагландинов.

Механизм необратимого ингибирования циклооксигеназы

Третьим показательным примером необратимого ингибирования является влияние антибиотика пенициллина на фермент транспептидазу , сшивающую цепи пептидогликана как последний шаг в синтезе клеточной стенки бактерий.

Обратимое ингибирование

При обратимом ингибировании происходит непрочное связывание ингибитора с функциональными группами фермента, вследствие чего активность фермента постепенно восстанавливается.

Примером обратимого ингибитора может служить прозерин , связывающийся с ферментом ацетилхолинэстеразой в ее активном центре. Группа ингибиторов холинэстеразы (прозерин, дистигмин, галантамин) используется при миастении, после энцефалита, менингита, травм ЦНС.

Конкурентное ингибирование

При таком виде ингибирования ингибитор по своей структуре похож на субстрат фермента. Поэтому он соперничает с субстратом за активный центр (за контактный участок), что приводит к уменьшению связывания субстрата с ферментом и нарушению катализа. В этом состоит особенность конкурентного ингибирования – возможность усилить или ослабить ингибирование через изменение концентрации субстрата. При данном ингибировании максимальная скорость реакции остается вполне достижимой при создании высоких концентраций субстрата.

Например:

1. Ингибирование фермента цикла трикарбоновых кислот сукцинат-дегидрогеназы малоновой кислотой , структура которой схожа со структурой субстрата этого фермента – янтарной кислоты (сукцината).

Конкурентное ингибирование сукцинатдегидрогеназы

2. Также к конкурентным ингибиторам относят антиметаболиты или псевдосубстраты , например, антибактериальные средства сульфаниламиды , схожие по структуре с пара-аминобензойной кислотой, компонентом фолиевой кислоты . При лечении сульфаниламидами в бактериальной клетке возникает конкуренция между сульфаниламидом и пара-аминобензойной кислотой при синтезе дигидрофолиевой кислоты, что и вызывает лечебный эффект.

3. В качестве других примеров лекарственных конкурентных ингибиторов можно привести

• ингибитор синтеза холестерина ловастатин , обратимо ингибирующий ГМГ-S-КоА-редуктазу ,
• противоопухолевый препарат метотрексат , необратимо подавляющий дигидрофолатредуктазу ,
• непрямой антикоагулянт дикумарол , конкурент витамина К ,
• антигипертензивный препарат метил-ДОФА , подавляющий активность ДОФА-декарбоксилазы ,
• средство для лечения подагры аллопуринол , ингибирующий ксантиноксидазу .

Примером конкуренции, но не ингибирования (!) , является взаимодействие этанола и метанола за активный центр алкогольдегидрогеназы . В данном случае ингибирование, как таковое, отсутствует, но с активным центром фермента связывается тот спирт, концентрация которого больше. Данный эффект используют у пациентов с отравлением метанолом для которого этиловый спирт является антидотом.

Неконкурентное ингибирование

Данный вид ингибирования связан с присоединением ингибитора не в активном центре, а в другом месте молекулы. Но при этом меняется структура активного центра и связь с субстратом становится невозможной. Это может быть аллостерическое ингибирование, когда активность фермента снижается естественными модуляторами, или связывание с ферментом каких-либо веществ вне активного и аллостерического центра. Например:

• синильная кислота (цианиды) связывается с гемовым железом ферментов дыхательной цепи и блокирует клеточное дыхание,
• связывание ионов тяжелых металлов (Cu 2+ , Hg 2+ , Ag +) с SH-группами белков.

Также примером может служить фруктозо-1,6-дифосфат, который ингибируя аденилосукцинатсинтетазу (синтез пуриновых нуклеотидов), синхронизирует в мышце функционирование пуриннуклеотидного цикла и гликолиза, поставлющего энергию для мышечного сокращения.

Особенностью неконкурентного ингибитора является его способность связываться с ферментом независимо от субстрата, т.е. изменение концентрации субстрата никак не влияет на образование комплекса фермент-ингибитор.

Бесконкурентное ингибирование

В этом случае ингибитор связывается в активном центре с фермент-субстратным комплексом. Повышение концентрации субстрата, увеличивая количество фермент-субстратного комплекса, усиливает и связывание ингибитора с ним. Таким образом, бесконкурентное ингибирование более сложно, чем другие типы ингибирования.

В качестве примера бесконкурентного ингибирования обычно называют связывание пенициллина и фермента транспептидазы , обеспечивающей сшивку цепей пептидогликана при синтезе клеточной стенки бактерий.

Пенициллин встраивается в активный центр фермента и его лактамное кольцо мимикрирует под переходное состояние фермента - фермент-субстрат. Хотя ситуация похожа на конкурентное ингибирование, из-за одновременного снижения Vmax и Km этот случай относят к бесконкурентному.

На примере пенициллина также рассматривается т.н. суицидное ингибирование . При нем субстрат первоначально связывается с ферментом обратимо, а затем образует устойчивое ковалентное соединение с активным центром, что приводит к ингибированию активности фермента.

Смешанное ингибирование

При таком ингибировании ингибитор способен присоединяться везде – не только в активном центре, но и в других частях молекулы. Но после этого фермент еще способен частично сохранять свою активность. Примером является влияние мертиолата (ртутьорганическое вещество) на сахаразу грибов микромицетов для подавления их роста.